珍藏版 史上最全的基因编辑常用技术指南(2)

二、TALENs
TALENs在基因编辑技术上迈出了一大步。该模块系统基于从Xanthomonas spp分离的TAL效应子DNA结合蛋白与FokI核酸内切酶的融合。经验丰富的科学家制作ZFN可能需要六个星期的时间，而TALENs技术的出现使得新手在短短几天内便能完成TALEN的构建。
TAL中心靶向结构域由33-35个氨基酸重复序列组成。这些重复由两个彼此不同的氨基酸组成，也就是它们的重复可变双残基（repeat-variable di-residue，RVD）。最终，正是这种RVD决定了TAL效应子（TALe）将识别出哪个单核苷酸：HD靶向胞嘧啶、NI靶向腺嘌呤、NG靶向胸腺嘧啶和NN靶向鸟嘌呤。
由于ZF靶标仅限于由具有相应锌指的三联体组成的序列，因此平均每500bp基因组中有潜在的可靶向位点。TAL效应子有一些限制，例如目标必须以T开头，但它们仍然具有大约每35bp就可以找到的潜在目标位点。

三、Cre-Loxp
Cre-loxp是一个非常有趣的工具，该工具可用于在转基因动物、胚胎干细胞和（或）组织特异性细胞类型中创建特定的靶向DNA修饰。现已广泛用于控制基因表达、Cre重组酶在各种启动子的控制下或以其可诱导的形式对基因表达进行复杂的时空控制，尤其是在转基因小鼠研究中的应用尤为广泛。
Cre-loxp系统的组成及原理：
Cre-loxp系统由源自P1噬菌体的两个成分组成：Cre重组酶和loxP识别位点。
Cre重组酶最初命名是因为它“引起重组（ causes recombination）”，后来也称之为“环化重组酶（cyclization recombinase）”，它是一个38 kDa的蛋白质，在loxP识别位点负责分子内和分子间的重组。该系统的主要优势在于Cre的作用不依赖于任何其他辅助蛋白或辅因子，因此可广泛用于各类实验中。
LoxP（(Locus of X(cross)-over in P1）则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，核心序列的不对称赋予了loxP位点方向性，典型的loxP序列为ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。loxP序列在除P1噬菌体之外的任何已知基因组中都不是天然存在的，并且由于足够长，几乎没有机会随机出现。因此，在DNA序列感兴趣的位置插入loxP位点可以进行非常特殊的操作。
具体原理：
Cre重组酶介导两个loxP位点之间的位点特异性重组事件，这些位点可以位于相同或不同的DNA片段。单个loxP位点上，每个13 bp重复序列均被Cre蛋白识别并结合，形成二聚体。然后，两个loxP位点以平行方向排列，从而允许四个Cre蛋白形成四聚体。双链DNA断裂发生在每个loxP位点的核心间隔区内，然后两条链被连接，从而导致相互交换事件发生。
根据loxP位点的位置和方向，有以下三种情景：
1. Inversion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转；
2. Deletion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列；
3. Translocation：当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。